BOD5测定通常采用标准稀释与接种法(GB 7488--87)，其操作为，经中和及除去毒性物质并经稀释后的水样(必要时加入适量含好氧微生物的接种液)置入培养瓶中，于在20oC暗处培养5d，通过分别测定培养前后水样中溶解氧的含量，来计算出5d内的耗氧量，再根据稀释倍数求得其BOD5。
BOD5的测定是生物作用和化学作用的共同结果，必须严格按照操作规范进行，变更任何一个条件，都将影响测定结果的准确性和可比性。影响BOD5测定的条件包括pH值、温度、微生物种类和数量、无机盐含量、溶解氧和稀释倍数等。
化验BOD5的水样必须充满并密封于取样瓶中，在2～5oC的冷藏箱内保存到分析时。一般应在采样后6h内进行检验，在任何情况下，水样的贮存时间不能超过24h。
测定工业废水的BOD5时，由于工业废水通常溶解氧含量较少而且成分多为可生化降解的有机物，为保持培养瓶内的好氧状态，必须将水样稀释(或接种稀释)，这一操作是标准稀释法的最大特征。为确保测得结果的可靠性，对于稀释后的水样培养5d的耗氧量必须大于2mg/L，残留溶解氧必须大于1mg/L。
投入接种液是为了保证有一定量的微生物降解水中的有机物，接种液的量以使5日耗氧0.1mg/L以下为佳。使用由金属蒸馏器制备的蒸馏水作为稀释水时，应注意检查其中的金属离子含量，以避免因此抑制微生物繁殖和代谢。为确保稀释水中溶解氧接近饱和，必要时可通入净化空气或纯氧，然后于在20oC培养箱中放置一定时间，使之与空气中氧分压达到平衡。
稀释倍数的确定是以培养5日耗氧大于2mg/L，剩余溶解氧大于1mg/L为原则。稀释倍数过大或过小，都会导致检验失败。而且由于BOD5分析周期较长，一旦出现类似情况，就无法以原样补测。初测某一工业废水的BOD5时，可以首先测定其CODCr，然后查阅参考已有的水质类似的废水的有关监测数据，初步确定待测水样BOD5/CODCr值，据此推算出BOD5的大致范围和确定稀释倍数。
对含有抑制或杀灭好氧微生物代谢活动的物质的水样，直接用通常方法测定BOD5的结果会偏离实际值，必须在测定前做相应的预处理，这些对BOD5测定有影响的物质和因素包括重金属及其他有毒的无机物或有机物、余氯等氧化性物质、pH值过高或过低等。
