稀释水的质量对BOD5的测定结果的准确性意义重大，因此要求稀释水空白5日耗氧必须小于0.2mg/L，最好能控制在0.1mg/L以下，接种稀释水5日耗氧应在0.3~1.0mg/L之间。
保证稀释水质量的关键在于控制其有机物的含量最低和抑制微生物繁殖的物质含量最低，因此最好使用蒸馏水作为稀释水，不宜使用离子交换树脂制得的纯水作为稀释水，因为去离子水往往含有从树脂中分离出的有机物。如果制备蒸馏水的自来水中含有某些挥发性有机物，为预防其残留在蒸馏水中，就应在蒸馏前进行去除有机物的预处理。由金属蒸馏器制得的蒸馏水，应注意检查其中的金属离子含量，以免发生抑制微生物的繁殖和代谢，影响BOD5测定结果的准确性。
如果所用稀释水因含有有机物而不符合使用要求时，可采取加入适量曝气池接种液后，在室温或20oC条件下贮存一定时间的方法予以消除影响。接种的量以5d耗氧约0.1mg/L为原则，为防止藻类繁殖，贮存必须在暗室中进行。如果贮存后的稀释水有沉渣，只能取用上清液，可过滤去除沉渣。
为确保稀释水的溶解氧接近饱和，必要时可用真空泵或水射器吸入经净化的空气，也可用微型空压机注入经净化的空气，还可用氧气瓶通入纯氧，然后将经过充氧的稀释水在20oC培养箱中放置一定时间，使溶解氧达到平衡。冬季在较低室温放置的稀释水可能含有过多的溶解氧，夏季高温季节则恰好相反，因此在室温与20oC有明显差别时，一定要放置在培养箱内稳定一段时间，使之和培养环境的氧分压平衡。
